Передовые геномные исследования длинных прочтений с использованием технологии секвенирования SMRT

Компания PACIFIC BIOSCIENCES, стремясь преодолеть трудности, возникающие при проведении исследований генома, приступила к разработке технологии, призванной расширить границы возможного при проведении секвенирования. В результате возникла технология одномолекулярного секвенирования в реальном времени длинных прочтений, которая использует естественный процесс репликации ДНК для наблюдения за ее синтезом. Эта уникальная технология позволяет проводить передовые исследования и  предоставляет результаты, необходимые для генетических открытий.

Технология SMRT основывается на двух ключевых новшествах: волноводах с нулевой модой (zero-mode waveguides/ZMW) и флоурофорах, пришитых к терминальной фосфатной группе нуклеотидов. Волноводы ZMW подводят свет исключительно к нижней части ячейки, в которой иммобилизован комплекс ДНК-полимераза – матрица для синтеза. Нуклеотиды с флуоресцентными метками позволяют наблюдать за иммобилизованным комплексом, так как ДНК-полимераза синтезирует совершенно естественно цепь ДНК. 

Преимущества технологии SMRT

Данная технология секвенирования идеально подходит для различных научно-исследовательских задач и имеет множество преимуществ, включая:

• большую среднюю длину прочтений;
• высочайшую консенсусную точность;
• равномерное покрытие;
• одновременное получение эпигенетической характеристики;
• секвенирование по одной молекуле.

Получение отличных результатов при помощи высококачественных длинных прочтений

По мере развития геномных исследований в научном сообществ все больше и больше растет осознание важности длинных прочтений при секвенировании. Секвенирование длинных прочтений повышает картируемость генома для повторного секвенирования и облегчает сборку при независимом секвенировании (de novo). Установка PacBio Systems позволяет проводить прямое секвенирование ДНК и получать длинные прочтения при равномерном покрытии. Технология одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT) позволяет стабильно получать в среднем одни из самых длинных прочтений доступных в сфере геномных исследований на сегодняшний день (в среднем >15 000 п.н., некоторые прочтения >100 000 п.н.).

Длинные прочтения по технологии SMRT дают возможность:

• производить высококачественную полногеномную сборку de novo;
• составить каталог полноразмерных изоформ;
• однозначно упорядочить последовательности;
• наблюдать полностью фазированные аллели;
• работать с повторяющимися элементами и сложными участками;
• охватывать повторяющиеся элементы и сложные участки;
• различать структурные варианты. 

Установки секвенирования PacBio дают возможность производить исключительно длинные прочтения без снижения производительности

Рис 1.

Вышеприведенные данные о длине прочтений получены из отобранной по размеру 35 кб библиотеки E. coli на установке секвенирования Sequel System с использованием комплекта для подготовки образцов Express kit, набора реагентов 2.1 Chemistry и ПО 5.1 Sequel System Software.

Высокая степень доверия к результатам секвенирования благодаря высочайшей консенсусной точности

Технология одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT) обеспечивает высочайшую точность получаемых результатов с консенсусной точностью более 99,999% (Q50)*. Благодаря высокой точности, малой системной погрешности под влиянием окружения при секвенировании и точному картированию прочтений данная технология позволяет получать информацию, необходимую для надежного распознавания и обнаружения вариантов.

Очень низкие значения системной погрешности означают, что секвенирование по технологии PacBio SMRT позволяет достигать высочайших показателей консенсусной точности.

Рис. 2

Данные получены при использовании библиотеки E. coli  размером 25 кб на установке секвенирования Sequel System с использованием набора реагентов 2.1 Chemistry и ПО SMRT Analysis v 5.1.

Полногеномное секвенирование с равномерным покрытием

Для большинства технологий секвенирования характерна неравномерность покрытия, что приводит к возникновению сложностей при секвенировании АТ- и ГЦ- богатых участков ДНК, высокоповторяющихся последовательностей, длинных гомополимеров и палиндромических последовательностей. Это часто приводит к неполному покрытию генома, так что почти 15% генома не попадает в конечный результат.

Технология одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT) не требует проведения амплификации и обеспечивает равномерное покрытие всего генома. Это позволяет секвенировать палиндромические и схожие участки. Длинные прочтения также позволяют покрывать сложные участки.

Технология секвенирования PacBio на основе длинных прочтений обеспечивает равномерное среднее покрытие генома даже на ГЦ-богатых участках.

Рис. 3

Данные получены при использовании библиотеки H. sapiens размером 40 кб на установке секвенирования Sequel System с использованием набора реагентов 2.1 Chemistry и ПО SMRT Analysis v 5.1.

Полногеномное секвенирование с одновременным получением эпигенетической характеристики

Принимая во внимание основную роль эпигенетических явлений во многих естественных и патологических процессах, наличие средств для обнаружения тех или иных изменений является ключом к более глубокому пониманию сложных биологических систем. Технология одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT) и соответствующее ПО дают исследователям возможность обнаруживать модификации ДНК и измерять скорость включения основания ДНК в цепь во время секвенирования.

Получение эпигенетической характеристики придает глубину генетическим исследованиям и дает возможность:

• находить участки (мотивы) узнавания метилтрансферазы в бактериальном геноме;
• определять локализацию метилирования аденина и цитозина;
• обнаруживать встроенные последовательности и химические модификации;
• различать нитеспецифичные модификации;
• осуществлять безгипотезный поиск.

Технология секвенирования PacBio SMRT позволяет обнаруживать эпигенетические модификации по их влиянию на кинетику полимеразы.

Рис. 4 

Полимеризация ДНК протекает свободно со скоростью 3 основания/сек. Изменение данного показателя по причине встраивания нуклеотидов с модифицированными основаниями можно обнаружить и на этом основании сделать вывод о присутствии оснований отличных от А, Ц, Т или Г. Данная информация автоматически генерируется и обрабатывается при каждом прогоне.

Получение генетической характеристики сложных сообществ по одной молекуле

Различение тесно связанных молекул ДНК различного происхождения в одном и том же образце требует проведения секвенирования по одной молекуле с высочайшей точностью и на длинных прочтениях. Для подобных приложений мы разработали специальный режим секвенирования, при котором создается внутримолекульная консенсусная последовательность, так называемое «циклическое консенсусное секвенирование»  (Circular Consensus Sequencing/CCS).

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени (SMRT) является единственной технологией, которая обеспечивает подобную консенсусную точность по одной молекуле при длине прочтений в десятки килобайт. Данная технология уже была использована для многих исследований сложных сообществ и дает возможность:

• выделить из сложной смеси уникальные гаплотипы;
• точно опредить соматические вариации;
• определить видовой состав сложных сообществ.

Технология секвенирования PacBio, основанная на применении циклического консенсусного секвенирования, позволяет обеспечить высокую точность длинных прочтений на уровне одной молекулы.

Рис. 5

Круговая конфигурация матрицы ДНК библиотеки SMRTbell позволяет полимеразе секвенировать одну и ту же молекулу ДНК много раз за большое число проходов. Это позволяет достичь высокой внутримолекулярной консенсусной точности.

* Показатель качества QV = -10 х log10(p). Например, QV 20 – точность 99%, QV 30 – 99,9%, и QV 50 – 99,999%.